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激酶药物筛选(HTRF法)



HTRF 原理

HTRF(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)技术基于时间分辨荧光( time resolved fluorescence TRF)和 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer FRET)两大技术原理。

时间分辨荧光 (TRF)利用稀土元素中镧系元素的独特性质。它们与普通荧光的主要区别是荧光的?#20013;?#26102;间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级,镧系元素的半衰期是毫秒级,有6 个数量级的差别。所以,在检测时,TRF 有一个时间延迟--50微秒。经过这个时间延迟,普通荧光的信号几乎为零。所以,TRF 的背景非常低, 反映样品的实?#26159;?#20917;。

 

荧光共振能量转移(FRET)技术利用了两种荧光基团的能量转移,这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)Donor 被外来光源激发(例如氙灯或激光), 如果它与Acceptor 比较接近,可以将能量共振转移到Acceptor上,使其受到激发,发出特定波长的发射光。

 

Donor Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合,生物分子的结合可以将Donor Acceptor 拉到足够近的距离,产生能量转移。由于Acceptor 的发射光来?#26434;?#33021;量转移,所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开,即不需要洗涤步骤。

 

HTRF 的能量供体

HTRF 的能量供体是铕(Eu)和铽(Tb)的穴状化合物。在这个穴状化合物里,Eu Tb 被永久地嵌合在一个笼子里,结构非常稳定。这个结构是由 J.M. Lehn’s 教授发明的,并由此在1987 年获得了诺贝尔奖。

HTRF的能量受体

HTRF的能量受体也有两种,XL665d2。它们的光学性质相同,分子量不同。前者分子?#35838;?/span>105 KD,实际上就是别藻蓝蛋?#31069;?/span>APC)。我们将APC的亚基偶联在一起,使其不能解离,提高了稳定性。后者分子?#35838;?/span>1 KD, 在某些实验中有独特的优势。

 

HTRF的操作步骤

HTRF的操作步骤非常简单,只需要将实验所需?#32422;?#21152;进去,然后孵 育、检测?#32431;傘?/span>

 

HTRF的应用

G蛋白偶联受体研究:受体第二信使检测受体配体结合胞内信号分子检测

激酶活性检测:胞外激酶活性检测胞内激酶活性检测

生物标志物检测:基于抗体的夹心法和竞争法检测

抗体检测:抗体重链含量测定、抗体轻链含量测定

生物过程分析:GST含量测定、HIS含量测定、CHO宿主蛋白含量测定

免疫过程分析:CD16结合检测、CD32结合检测、CD64结合检测

相互作用分析:蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-DNA、蛋白-RNA

蛋白修饰:蛋白甲基化、蛋白乙酰化、蛋白?#26680;?#21270;、蛋白水解

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 胞外激酶检测

一,检测?#32422;?#30418;
Cisbio激酶检测,是基于抗体的检测产物生成的解决方案,其特异性各不相同。包括:
1)基于ADP定量的适用于所有激酶的ADP Transcreener检测?#32422;梁校?/div>
2)利用通用底物的经过两百多种激酶验证的KinEASE ?#32422;梁校?/div>
3)利用特定底物、特异抗体的HTRF工具箱解决方案。
 
二,检测方法
这所有的检测方案,操作步骤都是一致的。
1)激酶反应:加入激酶、底物、ATP,室温进行激酶反应;
2)检测步骤:激酶反应完毕,加入能量供体Eu和能量受体XL665/d2标记?#32422;粒?#23460;温孵育1小时,读数。
 
三,实验步骤示意图
 
 
?#27169;琄inEASE TK?#32422;?#30418;
KinEASE TK?#32422;?#30418;适用于所有酪氨酸激酶的检测。?#32422;?#30418;提供生物素标记的底物、Eu标记的磷酸化位点特异性抗体、XL665标记的亲和素以及缓冲液。激酶将底物磷酸化,Eu-Ab识别磷酸化底物,XL665-SA与底物上的生物素结合。Eu与XL665接近,产生HTRF信号。经过验证的激酶列表:

五,KinEASE STK?#32422;?#30418;
KinEASE STK?#32422;?#30418;是用来进行丝氨酸/苏氨酸激酶检测的?#32422;梁小?#26681;据激酶的不同,该?#32422;?#30418;有三个通用底物可供选择,分别为S1、S2和S3,经过验证的激酶有一百多种。对于没有经过验证的激酶,可以用Discovery?#32422;?#30418;确定合?#23454;?#24213;物,其中包括了三种底物。
?#32422;?#30418;的检测原理与实验步骤与KinEASE TK?#32422;?#30418;相同。经过验证的激酶列表:

 HTRF方法快速高效检测ZAP-70磷酸化

一、HTRF检测技术
是基于时间分辨荧光(TRF)和荧光共振能量转移(FRET)两大技术原理,而开发的高通量药物筛选利器。两种荧光基团分称为能量供体(Donor,Eu或Tb标记)和能量受体(Acceptor,XL665或d2标记)。当两者比较接近,通过能量共振可以将能量转移到能量受体上,使其受到激发,发出特定波长的发射光。 
HTRF检测?#32422;梁校?#23601;是综合利用抗原抗体的特异性结合反应,受体供体间能量共振转移而开发的,高灵敏度,快速免洗,低背景的高通量检测技术。
二、ZAP-70
是酪氨酸蛋白激酶家族的一员,通常表达在T 细胞和自然杀伤细胞内,是T细胞受体的一部分,在T细胞信号转导中起重要作用。其319位的酪氨酸磷酸化是T细胞激活的表?#31181;?#19968;,通常用来检测重组蛋白对PD-L1的抑制作用。
 
三、ZAP-70检测的?#32422;?#30418;
基于抗体夹心法,用于磷酸化ZAP-70和总ZAP-70检测的?#32422;梁校?#23601;是将磷酸化ZAP-70,正常ZAP-70蛋白的捕获抗体和检测抗体分别标记为能量供体和能量受体,当两者结合在一起时,?#32431;?#36890;过能量转移信号被检测到。
 
四、技术特点
4.1 高效简洁的操作
在一个96?#35013;?#37324;培养,刺激,裂解细胞后,将裂解液转入384孔检测板,加入捕获抗体和检测抗体孵育30min,?#32431;?#19978;机检测。
 
 
4.2 高灵敏度
T175的培养瓶培养Jurkat细胞,收集细胞悬液用CD3抗体刺激细胞2.5min后,裂解细胞,分别进行HTRF和WB检测,无论是对磷酸化ZAP-70还是总ZAP-70的检测灵敏度,HTRF都远高于WB,详情参见下图:
 
 
4.3 免疫检查应用
 Jurkat细胞分别与不同浓度的重组PD-L1共孵育培养24h后,用CD3抗体刺激后,利用HTFR?#32422;梁校?#20998;别检测磷酸化ZAP-70和总ZAP-70,并用总ZAP-70量进行校准,进而评价重组PD-L1对CD3引起的Jurkat细胞的ZAP-70磷酸化影响。
 
五、?#32422;?#30418;信息
 
 

货号:HTRF001

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